【产品名称】

通用名称：IgA肾病免疫活动性检测试剂盒（ELISA）

【包装规格】

96T/盒

【预期用途】

用于定量检测人血清或血浆中的IgA复合物的含量，临床上主要用于IgA肾病的辅助诊断、疗效评估、病情跟踪。

【检验原理】

本试剂盒采用酶联免疫吸附试验（ELISA）。将HQP001蛋白包被于酶标板上，加入多聚IgA校准品或待测样本，结合后充分洗涤，再加入HRP标记的抗人IgA抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相蛋白-抗体-酶标抗体的复合物。加显色底物A和B，底物在 HRP 催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪上测定吸光度（OD 值），吸光度（OD 值）与待测样品中IgA复合物的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中人IgA复合物的浓度。

【主要组成成分】

注：不同批号试剂盒之间的组分不能互换。

缩略语

rPolyIgA：重组IgA复合物

HQP001：重组CD89蛋白分子

【需要但未提供的材料】

1. 酶标仪
2. 离心机
3. 单通道移液器
4. 8通道移液器
5. 漩涡震荡仪
6. 双蒸水或去离子水
7. 洗瓶或者自动洗板机
8. 37℃水浴锅或恒温箱

【储存条件和有效期】

1. 2℃～8℃保存，切勿冷冻，有效期12个月。
2. 开封使用后，酶标板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回4℃冰箱。
3. 开封后，按照建议的条件保存，校准品、HQP001蛋白和二抗-HRP，有效期为4周，其它成分在标签标明的有效期内是稳定的。

【适用仪器】

含 450nm 和 620-650nm 波长滤光片的酶标仪。

【样本要求】

1. 血清：全血或促凝管样品室温放置凝固后，1600×g离心10分钟（离心力g和转速rpm两者之间的换算公式如下所示：g=1.11×10^-5×R×rpm²，R为离心半径），取上清即可检测。通常血清样本2-8℃保存1周稳定，-20℃保存1个月，-80℃保存3个月以上，建议分小样保存，避免反复冻融。
2. 血浆：抗凝血采样后30分钟内处理，1600×g离心10分钟，取上清即可检测。通常血浆样本2-8℃保存1周稳定，-20℃保存1个月，-80℃保存3个月以上，建议分小样保存，避免反复冻融。
3. 避免使用溶血，高血脂样本。如果样本中检测物浓度高于校准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释。建议血清/血浆按 1：200 的体积稀释待检样本。

【检验方法】

1、预处理

1. 从4℃冰箱取出试剂盒平衡至室温，注意包被缓冲液及20×样本稀释液可能会出现结晶，需要完全溶解后方可使用。
2. 包被：将HQP001蛋白冻干粉复溶于11mL包被缓冲液中。可从11mL包被缓冲液中取1mL到HQP001蛋白冻干粉管中复溶，轻缓反复吸打使冻干蛋白充分溶解后转移到包被缓冲液中混匀。
3. 按照100μL/孔将蛋白包被液加到酶标板各孔中，加完后轻轻晃动使其均匀平铺板底。用封板膜封膜，室温（18-25℃），3小时孵育。
4. 按照200μL/孔计算封闭液的量，稀释封闭液母液成1×工作液。按照200μL/孔，洗涤14次计算洗涤液的用量，即N×200×14（N为样本孔数）。将洗涤液母液稀释成1×工作液。（注意母液稀释前无结晶）
5. 取出常温3小时孵育封膜酶标板，小心撕去封膜，垂直快速甩去孔中的溶液，在干净的吸水纸上拍干。按照200μL/孔加入洗涤液，静置1分钟,垂直快速甩去孔中的溶液，在干净的吸水纸上大力拍干。之后按照此洗涤步骤重复洗涤3次。
6. 封闭：按照200μL/孔加入 封闭液，封膜置室温（18-25℃）1小时。
7. 按照200μL/孔加入洗涤液，静置1分钟，垂直快速甩去孔中的溶液，在干净的吸水纸上大力拍干。之后按照此洗涤步骤重复洗涤3次。
8. 加样：将20×样本稀释液稀释成1×的工作液，取1mL 1×样本稀释液直接加入到校准品管中，用吸头轻轻吹打混匀，此时校准品浓度为500U/mL，之后稀释成STD1-STD6，浓度在500U/mL～15.63U/mL。取1mL 1×样本稀释液直接加入到质控品管中，用吸头轻轻吹打混匀，此时质控品浓度为250U/mL。

   	校准品浓度
   STD1	500U/mL
   STD2	250U/mL
   STD3	125U/mL
   STD4	62.5U/mL
   STD5	31.25U/mL
   STD6	15.63U/mL

9. 将待检测样本用1×样本稀释液稀释200倍。

2、检测步骤

1. 除空白孔外，按照100μL/孔，设置两个重复，将校准品、待检样本、质控品加入酶标板孔中，其中N加校准品浓度为0的样本稀释液100μL/孔，空白孔不加。封膜，室温（18-25℃）孵育1小时。
2. 静置1小时后，迅速甩去孔中溶液，并在吸水纸上大力拍干，操作时注意避免孔间液体相互污染。
3. 按照200μL/孔加入洗涤液，静置1分钟，垂直快速甩去孔中的溶液，在干净的吸水纸上大力拍干。之后按照此洗涤步骤重复洗涤3次。
4. 加二抗HRP：按照 1:5000 的比例，用1×样本稀释液稀释酶结合物，按照100μL/孔将稀释的HRP酶标抗人IgA抗体加入到酶标板孔中，封膜，室温（18-25℃）孵育0.5小时。
   注：配制工作酶结合物时建议按1.2×N×100μL配制，避免配制体积不够。（N为样本孔数）
5. 孵育0.5小时后，迅速甩去酶标板液体，吸水纸上大力拍干，按照200μL/孔加入洗涤液，静置1分钟，垂直快速甩去孔中的溶液，在干净的吸水纸上大力拍干。之后按照此洗涤步骤重复洗涤3次。
6. 显色：配制显色液，A液和B液1:1混合。显色液要现配现用。注意避光。显色液和终止液对人体有害，操作要小心不要接触皮肤。
7. 按照100μL/孔加入显色液，室温（18-25℃）避光显色10分钟。注意颜色变化程度，如颜色过蓝应视情况提前终止反应，如颜色过浅可视情况延长反应时间。
8. 终止：每孔加入终止液 50μL终止反应，轻轻震荡后在酶标仪上测定结果。
   注：终止液为强酸腐蚀液体，避免接触皮肤、金属，废弃时按实验室安全要求操作。
9. 设置酶标仪参数：双波长，第一波长450nm，参比波长第二波长620～650nm。
10. 测试结果，数据分析。

【检测质控】

质控物的质控范围打印在标签上。

每次实验都应包括质控品。

建议：如果质控结果与预期不符，实验室不应出具检测报告。

【结果计算】

检测完成后，以校准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD 值）作为横坐标，利用计算机软件，创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。

【参考区间】

对不同性别、年龄人群的临床样本进行研究，建议本试剂盒的参考区间为75.60U/mL。

由于不同地区、不同个体引起正常的、合理的差别，以及采用不同方法进行检测，其所测得IgA复合物水平也会有所不同，因此建议每个实验室均应针对自己的特色人群建立自己的参考值范围。本试剂盒的参考区间为患者样本稀释200倍后的参考区间。

【检验方法的局限性】

1. 检验结果仅供临床参考，不能单独作为诊断或排除病例的依据，对患者的临床管理应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
2. 在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。
3. 跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。

【产品性能指标】

• 空白限：应不高于10.0U/mL；
• 线性：在[15.63~500]U/mL区间内，线性相关系数（r）应不低于0.9900；
• 准确度：回收率应在（85%~115%）区间内；
• 重复性：变异系数（CV）应不大于10.0%；
• 批间差：变异系数（CV）应不大于15.0%；
• 校准品准确度：相对偏差不超过±10%；
• 校准品瓶内均一性：瓶内变异系数≤10%；
• 校准品瓶间均一性：瓶间变异系数≤15%；
• 质控品准确度：质控品测定值应该在试剂盒规定的质控范围内；
• 质控品瓶内均一性：瓶内变异系数≤10%；
• 质控品瓶间均一性：瓶间变异系数≤15%；

【注意事项】

警告和注意事项

IVD 供体外诊断使用

• 目前尚无已知的测试方法能完全确保人源性材料不具传染性，因此所有的人源性材料均应视为具有潜在的传染性。对于含有或可能含有感染源的物质，应按照生物安全等级2级或其他相应的生物安全规范执行。对于动物源性成份，应视作潜在感染性对待。
• 如使用冰箱中冷藏保存的检测试剂建议检测前应从冰箱内取出，放置到室温再打开使用，否则会影响检测结果。
• 在处理所有的实验室试剂时应进行常规的预防措施。
• 所有废弃物的处理均应遵循当地的法规进行。
• 在处理样本或试剂时应穿戴手套。
• 用适当的消毒剂对洒出的样本或试剂进行清洁和消毒。

【参考文献】

1. [ZHANG2021]ZhangX,et.al.Poly-lgA Complexes and Disease Severity in lgA Nephropathy. CJASN.16:16521664,2021.doihttps://doiorg/10.2215/CjN.01300121
2. [LV2019]LvJC,et.al.一种用于血清学诊断1gA肾病的分子探针。专利申请号：201910857929.9

【基本信息】

注册人/生产企业名称：深圳市陆为生物技术有限公司

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